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液相色譜柱的選擇、使用、維護和常見故障的排除

點擊次數(shù):2981 更新時間:2010-04-13
    液相色譜柱通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱,或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(ODS)稱為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。本文重點介紹反相色譜柱的選擇和使用:
一、反相色譜柱的選擇
1.柱子的PH值使用范圍
     反相柱優(yōu)點是固定相穩(wěn)定,應(yīng)用廣泛,可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料,使用時一定要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8,流動相的PH值小于2時,會導(dǎo)致鍵合相的水解;當(dāng)PH值大于7時硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況,色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時,建議選擇PH范圍大的柱子,例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2.填料的端基封尾(或稱封口)
     把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進行端基封尾,可改善對極性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了,有利于不易保留化合物的分離;填料穩(wěn)定性好了,組分的保留時間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物,選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。
二、液相色譜柱的使用
    色譜柱在使用前,進行柱的性能測試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是*條件),只有這樣,測得的結(jié)果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
a、使用流動相溶解樣品。
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不  可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動相的配制
    液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動相具備以下的特點:
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
b、流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)
c、流動相的黏度要盡量小,以便得到好的分離效果;降低柱壓降,延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器,使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實驗無法進行。   
f、在流動相配制好后,一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇
    因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱,要追求*柱效,使用*流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
    當(dāng)選用*流速時,分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時,可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意:
a.含水流動相在實驗前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。加入*,防止細(xì)菌生長。
b.流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾,除去微粒雜質(zhì)。
c.使用HPLC級溶劑配制流動相,使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。、
三. 色譜柱的維護
1. 色譜柱的平衡 
     反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。 每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱,您就會在處理問題方面獲得zui大的"補償",而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!操作步驟:
a. 平衡開始時將流速緩慢地提高,用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低,則需要較長的時間來平衡)
b. 如果使用的流動相中含有緩沖鹽,應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡; 分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。
2. 色譜柱的再生
    長期使用的色譜柱,往往柱效會下降(柱子的理論塔板數(shù)減低)。可以對色譜柱進行再生,在有條件的實驗室應(yīng)使用一個廉價的泵進行柱子的再生。
建議用來沖洗柱子的溶劑體積
色譜柱尺寸     柱體積     所用溶劑的體積
  125-4mm        1.6ml       30ml
  250-4 mm       3.2ml       60ml
  250-10mm       20ml        400ml
選擇再生方法:
    極性固定相(如Si,NH2*  ,DIOL基色譜填料)的再生:
    正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
    非極性固定相(如反相色譜填料RP-18,RP-8,CN等)的再生: 水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水
注意:
a. 在對NH2改性的色譜柱進行再生時,由于NH2可能以銨根離子的形式存在,因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗,然后再用水沖洗至堿溶液*流出。
b. 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱,如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì),在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。</P>
3. 色譜柱的維護
a.使用預(yù)柱保護分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度)
b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5,盡量不超過該色譜柱的pH范圍
c.避免流動相組成及極性的劇烈變化
d.流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理
e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相,應(yīng)在實驗完畢柱子沖洗干凈,并保存于甲醇或乙腈中
f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕

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